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肿瘤早筛甲基化解决方案

肿瘤防治，早筛早诊是关键的一环。肿瘤筛查是早期发现癌症和癌前病变的重要途径，可以有效地降低癌症的发病率和死亡率，减轻患者的疾病负担。

DNA甲基化的改变发生在癌变的早期，是一种具有价值的癌症生物标志物，目前在多种癌症筛查中均有广泛应用。DNA甲基化检测有什么优势？检测方法是什么呢？下面我们一起了解下DNA甲基化检测技术的相关知识。

DNA甲基化检测技术优势

高灵敏度和特异性：在肿瘤发生的早期阶段即可准确检测，大大提高了早期诊疗的可能性。

友好无创：甲基化检测通过血液、尿液、粪便、细胞样本就可以进行检测，操作简单且不会对患者造成身体上的伤害。

实时监测：可实时监测肿瘤的变化，有助于医生及时调整治疗方案，提高治疗的有效性。

应用场景

单癌种检测：一般指1 - 6个基因的数十个靶向甲基化位点检测，主要基于荧光PCR方法进行筛查。

泛癌种检测：一般指多个位点（数百至万级别）的靶向甲基化位点检测，主要基于NGS方法，利用不同组织、不同肿瘤甲基化表达谱的差距，结合机器学习来进行筛查。

肿瘤早筛甲基化检测流程

图1. 肿瘤早筛甲基化检测流程

肿瘤甲基化检测关键环节

第一步核酸提取

肿瘤DNA甲基化技术检测主要基于游离DNA、肿瘤基因组DNA进行，涉及多种样本类型：

游离DNA是指游离于细胞外的DNA片段，存在于如血清、血浆、尿液、脑脊液、胸腹水等多种样本中。游离DNA的释放及含量受多种因素影响，在无细胞液体样本中具有片段化程度高、丰度低等特性。产量多质量高的游离DNA是DNA甲基化检测的首要前提，因此游离DNA的纯化提取步骤就显得尤为重要。

肿瘤基因组DNA主要从靶向部位的脱落细胞和血液中获取，其中靶向部位的脱落细胞非常珍贵、微量，获取难度高。血液中的红细胞富含核酸酶，破裂后易降解白细胞中的目标核酸，且不同血液杂质成分不同，呈现多元且复杂的特性，使得提取环节的难度大大提升。

图2. 核酸提取实验流程

第二步甲基化转化

为便于后续检测，需要经过甲基化转化将基因组中的C和5mC区分开，该步骤有亚硫酸氢盐转化（BS转化）法和酶法共两种方式。

表1. BS转化法与酶法比较

实验方法	BS转化法	酶法
转化流程
方法原理	在高温和碱性条件下，DNA中的胞嘧啶（C）可被亚硫酸氢盐转化为尿嘧啶（U），而5-甲基胞嘧啶（5mC）则不会被转化。	通过氧化酶（TET酶）的级联反应，5mC和5hmC被转化成5caC；随后，氧化增强剂通过糖基化将5hmC转化成5ghmC；最后，在脱氨酶的作用下，未修饰的C变为尿嘧啶（U）。
方法比较	BS转化过程会导致约90%的DNA模板丢失，是造成建库起始量高、有效数据量低的“罪魁祸首”。	能够捕捉更多的甲基化位点，但是转化效率偏低，更要保证酶的稳定性，成本投入较高。

第三步 DNA甲基化检测下游分析

甲基化qPCR

经上述转化后，DNA模板中的的5’甲基胞嘧啶（5mC）转化为尿嘧啶（U），可通过检测特定位点碱基的差异，来达到肿瘤早筛的目的。如下图所示，在甲基化特异性探针的5’端偶联上了FAM基团，若为甲基化样本，则探针会与模板互补配对，在qPCR过程中，会不断释放FAM荧光信号。反之，在非甲基化模板上，探针无法互补配对，则不会释放FAM荧光信号。由此，可通过检测FAM荧光值得到C_T值，对甲基化进行定量。因其具备快速、灵敏、便捷等优点，已有20款获批临床检测试剂盒。目前常见的判定阳性的方式为靶标有无C_T值、ΔC_T值（靶标-内参）、靶标C_T>Cut off值、多基因联合等。

图3. 甲基化qPCR检测原理

甲基化建库

经过甲基化转化后模板是以单链DNA形式存在的，因此在进行甲基化建库时会有单链建库和双链建库两种方式，以下为两种建库方法的对比介绍。

表2. 单链建库与双链建库方法比较

实验方法	单链建库	双链建库
建库流程
建库顺序	先转化，再连接头	先连接头，再转化
接头种类	3’单链接头，5’双链接头	双链甲基化接头
特点	模板利用率、文库丰富度高，CpG位点检出多，不引入假阴性	模板需求量大，操作流程简便

诺唯赞DNA甲基化检测解决方案（产品组合列表）

诺唯赞提供从核酸提取、甲基化转化、到甲基化建库、甲基化qPCR的完整原料试剂解决方案以优质产品与专业服务，致力满足DNA甲基化更高检测需求，共同推进肿瘤早筛早诊高质量发展。

产品类别	产品名称	产品货号
核酸提取	VAMNE MagUltra Blood Genomic DNA Extraction Kit 磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒	DM101
	Magnetic Blood DNA Extraction Kit（Prepackaged）磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒（预封装）	DM102
	VAMNE MagUltra Circulating Cell-free DNA Isolation Kit 磁珠法游离DNA提取试剂盒	N913
BS转化	EpiArt DNA Methylation Bisulfite Kit V2 柱式亚硫酸氢盐转化试剂盒	EM102
	EpiArt Ultrafast Methylation Bisulfite Kit 柱式超快速预混亚硫酸氢盐转化试剂盒	EM112
	EpiArt DNA Methylation Bisulfite Magprep 磁珠法亚硫酸氢盐转化试剂盒	EM103
甲基化建库	EpiArt DNA Methylation Library Kit for Illumina V3 单链甲基化建库试剂盒	NE103
	EpiArt dsDNA Methylation Library Prep Kit for Illumina 双链甲基化建库试剂盒	NE201
	VAHTS HiFi Amplification Mix V3 甲基化文库扩增Mix	NE103-P1
甲基化qPCR	BioSmart MethyLight qPCR Mix 甲基化检测专用的探针法qPCR预混液	EM701
	BioSmart MethyLight DNA Polymerase 甲基化检测专用的探针法qPCR试剂	EM710
PCR扩增	2×EpiArt HS Taq Master Mix 甲基化PCR扩增试剂	EM201
	2×EpiArt HS Taq Master Mix(Dye Plus) 甲基化PCR扩增试剂（染料版）	EM202