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干货 | 详解肿瘤早筛“潜力股”——DNA甲基化技术

发布时间：

2024-05-16 00:00

肿瘤防治，早筛早诊是关键的一环。肿瘤筛查是早期发现癌症和癌前病变的重要途径，可以有效地降低癌症的发病率和死亡率，减轻患者的疾病负担。

DNA甲基化的改变发生在癌变的早期，是一种具有价值的癌症生物标志物，目前在多种癌症筛查中均有广泛应用。DNA甲基化检测有什么优势？检测方法是什么呢？下面我们一起了解下DNA甲基化检测技术的相关知识。

01. DNA甲基化检测技术优势

高灵敏度和特异性：在肿瘤发生的早期阶段即可准确检测，大大提高了早期诊疗的可能性。

友好无创：甲基化检测通过血液、尿液、粪便、细胞样本就可以进行检测，操作简单且不会对患者造成身体上的伤害。

实时监测：可实时监测肿瘤的变化，有助于医生及时调整治疗方案，提高治疗的有效性。

02. 应用场景

单癌种检测：一般指1 - 6个基因的数十个靶向甲基化位点检测，主要基于荧光PCR方法进行筛查。

泛癌种检测：一般指多个位点（数百至万级别）的靶向甲基化位点检测，主要基于NGS方法，利用不同组织、不同肿瘤甲基化表达谱的差距，结合机器学习来进行筛查。

03. 肿瘤早筛甲基化检测流程

图1. 肿瘤早筛甲基化检测流程

04. 肿瘤甲基化检测关键环节

第一步核酸提取

肿瘤DNA甲基化技术检测主要基于游离DNA、肿瘤基因组DNA进行，涉及多种样本类型：

游离DNA是指游离于细胞外的DNA片段，存在于如血清、血浆、尿液、脑脊液、胸腹水等多种样本中。游离DNA的释放及含量受多种因素影响，在无细胞液体样本中具有片段化程度高、丰度低等特性。产量多质量高的游离DNA是DNA甲基化检测的首要前提，因此游离DNA的纯化提取步骤就显得尤为重要。

肿瘤基因组DNA主要从靶向部位的脱落细胞和血液中获取，其中靶向部位的脱落细胞非常珍贵、微量，获取难度高。血液中的红细胞富含核酸酶，破裂后易降解白细胞中的目标核酸，且不同血液杂质成分不同，呈现多元且复杂的特性，使得提取环节的难度大大提升。

图2. 核酸提取实验流程

第二步甲基化转化

为便于后续检测，需要经过甲基化转化将基因组中的C和5mC区分开，该步骤有亚硫酸氢盐转化（BS转化）法和酶法共两种方式。

表1. BS转化法与酶法比较

第三步 DNA甲基化检测下游分析

甲基化qPCR

经上述转化后，DNA模板中未甲基化的胞嘧啶（C）转化为尿嘧啶（U），可通过检测特定位点碱基的差异，来达到肿瘤早筛的目的。如下图所示，在甲基化特异性探针的5’端偶联上了FAM基团，若为甲基化样本，则探针会与模板互补配对，在qPCR过程中，会不断释放FAM荧光信号。反之，在非甲基化模板上，探针无法互补配对，则不会释放FAM荧光信号。由此，可通过检测FAM荧光值得到C_T值，对甲基化进行定量。因其具备快速、灵敏、便捷等优点，已有20款获批临床检测试剂盒。目前常见的判定阳性的方式为靶标有无C_T值、ΔC_T值（靶标-内参）、靶标C_T>Cut off值、多基因联合等。