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干货 │ ATAC-seq文库出现单峰的原因解析及改进方案
发布时间：
2024-10-16 14:38
ATAC-seq的实验步骤可分为三个部分：制备细胞核悬液、转座、提取DNA进行扩增。
在细胞核质量良好的情况下，Tn5酶对开放染色质区域进行转座，由于核小体的分布特点，切割下来的DNA会形成200~1000 bp的ladder状文库峰型，但由于样本类型复杂多样，实际上并不总会得到理想的ladder状片段分布，那么当ATAC文库只出现一个单峰时，原因有哪些呢？这种情况下，要上机测序吗？
图1. 转座酶切割开放染色质区域示意图[1]
原因一：细胞(核)质量不佳
由于样本处理不当，如细胞样本保存不当，培养时间过长，组织样本反复冻融，细胞核制备过程中过于剧烈导致核小体解聚..... 都会使得细胞（核）质量差，致使染色质未能保持自然状态，原本紧密缠绕在核小体上的DNA被人为解离，导致Tn5转座酶对大量无核小体的裸露DNA进行切割，最后产生单峰。
该原因得到的ATAC-seq文库，其数据背景噪音高，严重时不可使用。因此在转座之前，通常会对细胞或细胞核进行质检，包括：
✫ 新鲜活细胞质检-台盼蓝染色（通常细胞活性应>80%）
✫ 细胞核质检-DAPI染色（核形态完整，杂质少）
关于细胞核，其实“形态完整”这个判断指标比较主观，什么样的形态就叫完整呢？对于一些植物组织，杂质较多时，在显微镜下就更难看清细胞核形态了，导致主观判断离真实情况偏差较大。这样就会出现以为细胞（核）质量良好，实际上质量不好的现象发生。这里展示一张10 x genomics提供的细胞核形态供大家参考（图2）。
图2. 10 x genomics对细胞核形态的判断：
质量好（左A），质量差（右B）
小结：
当ATAC-seq文库出现单峰时，如果能明确是细胞或细胞核质量差导致的，则不建议上机测序（测序后的结果大概率会背景很高）。
原因二：细胞(核)数量相对过少
（Tn5酶量相对过多）
2013年的ATAC-seq方法学文章中写明了通常使用5万个细胞进行转座，后来大量的研究也延用了5万个细胞的投入量，而细胞投入量在一定范围内是与转座的酶量相对应的（使用诺唯赞TD501的用户更能理解DNA投入量与Tn5酶量应该相匹配）。但当两个物种基因组大小相差很大时，可被转座酶切割的开放区域总和也会存在较大差别，如果使用相同的酶量，其切割后的片段分布模式也会出现差异。另外，使用相同的酶量，对500个细胞与5万个细胞进行转座，如下图3所示，得到的片段分布是有差异的，500个细胞的单峰更多。
图3. 相同Tn5酶量对同种细胞不同细胞数量的ATAC建库峰图：500个细胞(左)，5万个细胞(右)
当过量的Tn5酶都集中将NFR区切下来，两个核小体以上的片段几乎没有，一个核小体的片段相比NFR区也大大减少，这个时候多峰现象不再明显，看上去则呈现出单峰模式了。然而，在细胞（核）质量本身较好的前提下，即便出现单峰，仍然不影响TSS富集，数据质量依然较高，是可以继续使用的。如下图4所示。
图4. 从左至右：小鼠细胞核染色、ATAC-seq插入片段分布、TSS富集热图
小结：
当ATAC-seq文库出现单峰时，如果能明确细胞（核）质量较好，可能是细胞实际投入量过少的原因，则建议继续上机测序。
那么如何避免实际细胞（核）投入量与Tn5酶量相差太大导致的不平衡问题呢？
诺唯赞ATAC-seq试剂盒TD711针对Tn5酶进行了工艺改造，使得其对细胞量的投入范围大幅拓宽，相同酶量下，能够兼容100 个- 10万个细胞量，无需固定投入5万个细胞进行转座，一套流程，操作更加简单。
图5. Vazyme #TD711试剂盒对不同投入量细胞进行ATAC建库的TSS富集热图
原因三：扩增不均一致使小片段优先扩增
转座后回收DNA进行扩增，PCR扩增酶的活性影响扩增效率，如果酶活性不足，不同模板或区域的扩增效率差异增大，若使用的扩增酶进行长片段扩增的能力不足，小片段优先被富集，文库则可能出现单峰。但如果能明确细胞（核）质量较好时，单峰中的NFR信号依然在TSS处富集，对最后数据分析的结果影响不大，这种情况下，则建议继续上机测序。
推荐使用诺唯赞ATAC-seq试剂盒TD711，其扩增模块不会出现扩增不均一的现象，同时使用了优化的提取磁珠，与纯化核酸的磁珠相比，能够更加高效的从细胞/组织样本中回收到转座后的DNA。
总结
当ATAC-seq文库出现单峰时，除了因细胞（核）质量不佳，还应关注实际细胞投入量与Tn5酶量是否匹配以及小片段扩增偏好性。后两个原因，诺唯赞ATAC-seq试剂盒TD711已帮您解决，因此主要原因也是最重要的因素则是细胞（核）质量了。面对万千物种的各类不同组织，很难有一套细胞核制备方法能满足所有需要，因此大量具有组织特异性的细胞核制备方法应运而生。期待会有更多创新方法问世，给科学研究带来更多惊喜！
今年以来，诺唯赞ATAC-seq建库产品已连续助力多家科研院所（包括清华大学、北京大学、上海交通大学等）研究成果发表于国际知名期刊。诺唯赞将持续创新，深度服务科研工作者，与大家共同成长。
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参考文献：
[1] Yan et al. From reads to insight: a hitchhiker’s guide to ATAC-seq data analysis. Genome Biology, 2020.
