VAHTS Library Quantification Kit for Illumina
Illumina平台高通量测序文库染料法绝对定量专用试剂盒
产品应用
测序文库浓度绝对定量；检测实验环境中文库污染程度
产品优势
包含定量所有必须组分
新型染料法qPCR预混液VAHTS SYBR qPCR Master Mix
扩增效率高、GC含量兼容性好
标准品定量准确，批次间CV值<5%
兼容所有主流定量PCR仪
性能展示
图1. 使用VAHTS Library Quantification Kit for Illumina绘制的标准曲线。
产品描述
本品是使用染料qPCR法进行Illumina平台高通量测序文库浓度测定的专用试剂盒。其工作原理为使用标准品绘制标准曲线，再根据标准曲线计算待测文库浓度。试剂盒采用了一种基于抗体法热启动的新型染料法qPCR预混液VAHTS SYBR qPCR Master Mix。该预混液具有特异性高、扩增效率高、 GC含量适应性广、检测灵敏度高等诸多优势，非常适合进行文库浓度的绝对定量。 试剂盒中提供的所有试剂都经过了严格的质量控制，较大程度上保证了不同批次间实验结果的可重复性。
根据反应时ROX Reference Dye是否需要添加及需要添加的种类分类，主流定量PCR仪可分为以下三类：
Type I 机型：不添加ROX Reference Dye
Bio-Rad CFX96,CFX384,Roche Z480,LC480,SLAN-96S.
Type II 机型：添加ROX Reference Dye 1
StepOne,StepOnePlus,Applied Biosystems 7300,7700,7900,7900HT,7900HT Fast.
Type III 机型：添加ROX Reference Dye 2
Applied Biosystems 7500,7500 Fast.NQ101
试剂盒中提供单独包装的ROX Reference Dye 1/2，适用于所有定量PCR仪。使用时根据上表选择适合的ROX Reference Dye。
储存条件
-30 ~ -15℃保存，≤0℃运输。Master Mix与ROX应避光。
Q1：上机簇密度低该如何解决？
A1：簇密度低可能是由于文库定量没有定准确导致上机的文库量不足导致的，建议重新定量。
Q2：扩增效率偏出90%~110%范围
A2：（1）如CT (NTC) - CT (DNA Standard 6) < 3或者CT (DNA Standard 6) - CT (DNA Standard 5) < 3.1，且计算扩增效率超过100%，提示反应体系有污染。应根据NTC阴性对照的融解曲线确认污染源(文库污染或DNA Standards污染)。绘制标准曲线时，应先根据CT (NTC)确定标准曲线有效CT值范围，舍弃受污染影响的CT，使用剩余的CT绘制。
（2）不恰当的基线设置会增大CT (DNA Standard 1)，进而影响扩增效率计算。手动调整基线为1-3循环。
（3）移液精确度差。
Q3：做完标准曲线，发现R2< 0.99，是什么原因？
A3：（1）移液精确度差。
（2）所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。
（3）仪器相关问题。确认所用ROX Reference Dye与定量仪器匹配。
Q4：复孔重复性差
A4：（1）移液精确度差。
（2）所有试剂在使用前应充分解冻并彻底混匀。
（3）仪器相关问题。确认所用ROX Reference Dye与定量仪器匹配。
Q5：DNA Standards有扩增，而文库没有或CT很大
A5：（1）文库接头序列错误：建议核对文库末端序列与试剂盒提供的引物序列是否匹配。
（2）稀释度过高：建议减少稀释倍数，重复实验。
（3）文库降解：文库应现用现稀释，稀释好的文库应置于冰上备用，用完丢弃。
