One Step Mouse Genotyping Kit
一步法小鼠基因型鉴定试剂盒
小鼠基因型鉴定
- 基于蛋白酶 K 的特制裂解液
- 裂解产物直接用于PCR扩增，无需提取基因组
- PCR扩增酶是蓝色Mix，加入引物和模板即可进行扩增，扩增产物可直接电泳检测
- 广泛适用于2 kb以内目标片段扩增，并适用于4对引物以内的多重PCR 反应
使用 One Step Mouse Genotyping Kit 以同一个粗提样品为模板，扩增17个不同的基因 (长度为 200 bp-800bp 之间)。所有片段均可以实现特异性高产量扩增。
M: DL2,000 Plus DNA Marker
本试剂盒包含整套的DNA粗提取以及PCR扩增体系，适用于小鼠基因型快速鉴定 (Rapid Genotyping)。可用于从小鼠尾巴、耳朵以及脚趾等组织中快速释放基因组DNA，产物可直接进行PCR扩增，无需匀浆、破碎、过夜消化、酚氯仿抽提、DNA沉淀或柱式纯化等操作，缩短了实验耗时。只需加入引物和模板即可进行扩增，减少了开管/移液等操作，降低了样品交叉污染风险，提高了检测通量和结果的重现性。独特的保护剂使得Taq Plus Master Mix经过反复冻融后仍可保持稳定的活性。体系中预混有电泳缓冲液和蓝色Loading Buffer，可在反应结束后直接进行电泳，使用方便快捷。
1 × Mouse tissue Lysis Buffer 4℃保存；其余组分-20℃保存。
Q1：PD101试剂盒中Proteinase K的储存以及裂解的注意事项
A1：Proteinase K存储条件为 -20℃。若经常使用，可将Proteinase K分管保存在-20度，防止反复冻融。裂解时可以将Proteinase K与Lysis Buffer混匀后放在常温下即可，再取小鼠组织，其他可参照说明书。
Q2：PD101试剂盒中的2 × Taq Plus Master Mix 中是否有Mg2+，另外的MgCl2如何用
A2：2 × Taq Plus Master Mix 中有Mg2+，浓度为1.5 mM。关于MgCl2的使用，可在扩增效率不佳的时候，用来调节反应条件，每次可增加0.5mM。
Q3：PD101试剂盒能否做其他物种
A3：确定可以做大鼠和小鼠。其他昆虫，哺乳动物也可以，但不能保证结果。建议尝试用P505，这款酶的直扩能力很强。
Q4：使用PD101，裂解孵育之后小鼠尾巴形态没变，是否裂解成功
A4：这是正常的现象。加入裂解液孵育之后已经有部分基因组DNA释放出来了，小鼠尾巴的形态改变不大。
Q5：PD101裂解组织后的裂解液可以用NanoDrop测DNA浓度吗
A5：不可以，因为裂解组织后的裂解液中的东西比较复杂，有buffer、蛋白酶K，而且DNA的浓度低，用NanoDrop测量容易虚高。
Q6：使用PD101，在一个反应体系中加入两对引物，扩增效果差
A6：可能两对引物会互相干扰，建议单独扩增。若一定要在同一个体系中进行，建议调整两对引物使用的比例，如果重新设计引物，在保证引物特异性的前提下，使四条引物的Tm值尽量接近，差值不要太大（2-3℃）；如果不重新设计引物，也可以适当调整退火温度，同时，适当延长退火时间（30s-1 min）。
Q7：扩增产量低或者无法扩增
A7：(1) 组织中的一些PCR抑制物混入裂解液中：可尝试将裂解产物稀释10倍后再进行PCR扩增；
(2) DNA释放效率较差：可尝试延长55℃孵育时间至3 h；
(3) Proteinase K没有充分灭活：灭活步骤在沸水浴中进行；
(4) PCR循环数不够：一般而言，30～35个循环已经足以扩增足量的产物。然而对于某些片段，提高循环数可以获得更好的扩增效果；
(5) 扩增反应退火温度设置太高：降低退火温度（每次降低3℃）；
(6) PCR引物错误：设置以纯化过的小鼠基因组为模板的阳性对照反应。
Q8：非特异性产物很多
A8：(1) PCR反应体系在室温下配制：在冰水浴中配制反应体系可显著降低非特异性扩增；
(2) 扩增反应退火温度设置太低：提高退火温度（每次提高2℃）；
(3) PCR引物错配严重：重新设计引物。
Q9：阴性对照出现扩增
A9：PCR反应体系出现污染：逐个更换组织裂解体系、PCR扩增体系中的每一个组分。
Q10：使用PD101小鼠趾甲裂解效果不好，孵育了近1h，可以提供什么建议
A10：（1）建议把组织块剪大一些，即与指甲接触的肌肉部分，并稍微延长孵育时间；
（2）建议从PCR体系、反应程序（设置阳性对照）上优化。
Q11：可以选择哪种酶来替换PD101试剂盒中的酶
A11：可以用高产量的Taq酶（P212/P213）替换。
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